На основании исследования взаимосвязи между концентрацией пиридоксальфосфата в плазме крови и экскрецией 4-пиридоксиловой кислоты с мочой, а также статистического анализа показано, что обмен витамина В-6 и, соответственно, критерии адекватной обеспеченности организма... этим витамином больных ФКУ детей отличаются от таковых у здоровых детей. Для больных детей характерно повышенное содержание пиридоксальфосфата в плазме крови. В качестве нижней границы достаточной обеспеченности витамином В-6 мы склонны рекомендовать его концентрацию 11 нг/мл. При потреблении повышенных доз витамина В-2 показатели обеспеченности витамином В-6 больных ФКУ детей приближаются к наблюдаемым у здоровых. Обсуждается необходимость уточнения и биохимического обоснования оптимального содержания в диете витаминов В-2 и В-6 при данном заболевании.

Ключевые слова: витамин В-6, витамин В-2, критерии обеспеченности витаминами, обмен витаминов, фенилкетонурия

ВВЕДЕНИЕ. Оптимальная обеспеченность витамином В-6 и ее корректная оценка имеют принципиальное значение для больных фенилкетонурией (ФКУ), поскольку этому витамину принадлежит важная роль в регуляции процессов возбуждения и торможения центральной нервной системы, нарушения в функционировании которой наблюдаются при этом заболевании. Витамин В-6-зависимые декарбоксилазы катализируют превращение глутаминовой кислоты в гамма-аминомасляную, декарбоксилируют ароматические аминокислоты, участвующие в образовании катехоламинов и серотонина, гистамина и других биогенных аминов, витамин В-6-зависимая трансфераза функционирует в реакциях обмена тирозина [1].

Данные об обеспеченности организма витамином В-6 при ФКУ противоречивы. Так, в некоторых работах у больных ФКУ детей выявлялась повышенная концентрация в плазме крови коферментной формы витамина В-6 - пиридоксальфосфата (ПАЛФ) [2, 3], уровень которого обычно используют в качестве показателя обеспеченности этим витамином. По мнению авторов, это обусловлено обнаруженным в их работе незначительным уменьшением активности щелочной фосфатазы плазмы крови и, возможно, сниженной скоростью обмена витамина В-6 [2]. По данным одних авторов, при нагрузке триптофаном у пациентов с ФКУ значительного увеличения экскреции продуктов витамин В-6-зависимого метаболизма этой аминокислоты не отмечалось, что свидетельствует о достаточной обеспеченности организма витамином В-6 [4]; тогда как, по данным других, - наблюдалось более чем двукратное увеличение выведения кинуренина, отражающее снижение активности ПАЛФ-зависимой кинурениназы вследствие дефицита витамина В-6 [5].

Таким образом, ясности в вопросе об обмене этого витамина при данном заболевании нет; проблема усложняется еще и тем, что в образовании пиридоксалевых коферментов из пиридоксина, поступающего с диетой, и его окислении в 4-пиридоксиловую кислоту (4-ПК), принимают участие витамин В-2-зависимые ферменты [6], и, следовательно, метаболизм витамина В-6 зависит от рибофлавинового статуса организма [7].

Вместе с тем, в упомянутых выше работах обеспеченность рибофлавином во внимание не принималась.

В данной работе была предпринята попытка охарактеризовать обмен витамина В-6 при ФКУ на основе изучения взаимосвязи между содержанием ПАЛФ в плазме крови и часовой экскрецией метаболита витамина В-6 с мочой с учетом обеспеченности организма витамином В-2. Данный подход позволил выявить особенности обмена водорастворимых витаминов при ряде заболеваний [8, 9].

МЕТОДИКА. Средний возраст 36 обследованных детей (20 девочек, 16 мальчиков 6-8 лет) составил 7,5 лет. Все дети получали элементную диету (на основе специализированных продуктов "Фенил-фри" (США) по 190-200 г или по 90 г "Тетрафена" (РФ) в сутки) в течение 1-7,5 лет, что обеспечивало потребление в среднем по группе 2,16+/-0,09 г белка на 1 кг массы тела (1,35-2,76 г/кг).

На момент исследования уровень фенилаланина в плазме крови составил 6,2+/-0,8 мг/дл (1,8-14,8 мг/дл), концентрация белка - 72,1+/-0,7 г/л (66,3-72,6 г/л).

Концентрацию ПАЛФ и пиридоксаля (ПАЛ) в плазме крови по реакции образования гидразона и 4-ПК в моче измеряли с помощью ВЭЖХ [10]. Рибофлавин в плазме крови определяли титрованием рибофлавинсвязывающим апопротеином [11].

Активность щелочной фосфатазы плазмы крови измеряли по гидролизу n-нитрофенилфосфата при 20С в среде объемом 1 мл, содержащей 6 мМ субстрата, 1 мМ MgCl2 , 100 мМ NaOH-глициновый буфер, рН 9,85, 0,1 мл плазмы крови. Через 20 мин реакцию останавливали 2 мл 0,2 М NaOH, измеряли оптическую плотность при 405 нм. Для расчета активности фермента использовали коэффициент молярной экстинкции n-нитрофенола 18500 М-1см-1.

Коэффициент ранговой корреляции между показателями обеспеченности организма витаминами рассчитывали по Спирмену [12]. Уравнения, описывающие ветви кривых зависимости между показателями обеспеченности организма витаминами, рассчитывали с использованием программы "Quattro-Pro, v.1.0" (Borland). В качестве показателей вариационных кривых распределения данного уровня ПАЛФ в плазме крови использовали доверительный интервал, стандартное квадратичное отклонение, медиану (Ме) и моду (Мо) [13].

В работе использовали рибофлавин, ПАЛФ, ПАЛ, 4-ПК фирмы "Serva" (ФРГ), остальные реактивы отечественного производства.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Между пиридоксиновым и рибофлавиновым статусом организма, оцениваемым по содержанию витамеров в плазме крови, обнаруживалась положительная ранговая корреляция (табл. 1). Как и в случае здоровых людей [14], у больных ФКУ детей наблюдалась явная зависимость экскреции продукта катаболизма витамина В-6 - 4-ПК от обеспеченности организма витамином В-2. Так, у больных ФКУ детей с выраженным дефицитом рибофлавина (концентрация в плазме крови менее 4 нг/мл) экскреция 4-ПК была достоверно (Р</=0,001) ниже, чем у адекватно обеспеченных витамином В-2, и составила 75+/-13 мкг/ч (n=9) против 145+/-11 мкг/ч (n=24). В обеих группах содержание ПАЛФ в плазме крови было одинаковым и достаточно высоким (18,9+/-2,2 и 18,8+/-1,5 нг/мл).

Таблица 1. Коэффициенты ранговой корреляции между показателями обеспеченности витаминами В-2 и В-6 больных ФКУ детей 6-8 лет

Параметр    r    n    Статистическая значимость

Концентрация рибофлавина в плазме крови -

концентрация ПАЛФ в плазме крови    0,313    28    Р</=0,05

Концентрация ПАЛФ в плазме крови -

часовая экскреция 4-ПК с мочой    0,479    28    Р</=0,01

В связи с этим для дальнейшего исследования обмена витамина В-6 принимались во внимание только показатели детей, адекватно обеспеченных витамином В-2.

На рис. 1 представлена гистограмма распределения частот встречаемости (в %) данной концентрации ПАЛФ в плазме крови 42 больных ФКУ детей, получавших помимо витамина В-6, содержащегося в продуктах естественного происхождения, по 1,7 мг пиридоксина за счет специализированного продукта, что близко к рекомендуемому суточному потреблению этого витамина для здоровых детей.

Полученное распределение достаточно близко к нормальному, характеризующемуся симметрией относительно средней по группе концентрации ПАЛФ (М=17,6 нг/мл), о чем свидетельствует близость к этой величине медианы (Ме=16,5 нг/мл) и моды (Мо=16,5 нг/мл). Представленная кривая распределения сильно сдвинута вправо (в область высоких концентраций) относительно обычно наблюдаемых кривых распределения для здоровых, хорошо обеспеченных витамином В-6 людей [15]. Средняя по группе концентрация ПАЛФ в плазме крови обследованных детей в 2 раза выше величины, принятой в качестве критерия адекватной обеспеченности витамином В-6 здорового ребенка (8 нг/мл). Обращает на себя внимание, что лишь у одного ребенка исследуемый показатель не достигал этой величины. Если у здоровых детей концентрации ПАЛФ в плазме крови, превышающие 20 нг/мл, встречаются крайне редко, то у половины обследованных больных ФКУ детей этот параметр оказался выше 16,5 нг/мл. Наблюдения о повышенном уровне пиридоксалевых коферментов в плазме крови согласуются с результатами других авторов, полученными при обследовании больных ФКУ детей школьного возраста [2, 3]. Однако данные этих авторов о сниженной активности щелочной фосфатазы плазмы крови у больных ФКУ детей, обнаруженные при использовании в качестве субстрата тимолфталеинмонофосфата, не подтвердились при использовании в качестве субстрата n-нитрофенилфосфата. Так, активность этого фермента у больных детей составила 23,0+/-1,4 Е/л (n=7) против 23,3+/-2,4 Е/л (n=10) у практически здоровых детей.

Рисунок 1. Гистограмма распределения частот встречаемости данной концентрации ПАЛФ в плазме крови больных ФКУ детей. По оси абсцисс - концентрация ПАЛФ в плазме крови, нг/мл; по оси ординат - относительное количество лиц с данным уровнем ПАЛФ в плазме крови, %. Сплошной вертикальной линией отмечен средний по группе уровень, пунктирными вертикальными линиями - доверительный интервал для математического ожидания. Сплошной кривой линией обозначено распределение частот встречаемости данной концентрации ПАЛФ в плазме крови здоровых адекватно обеспеченных витаминами В-2 и В-6 людей [15].

В соответствии с рассчитанным для данной выборки средне- квадратичным отклонением (6,5 нг/мл), в доверительный интервал для математического ожидания от 11,1 до 24,1 нг/мл попали показатели 78,6% обследованных. Из представленной гистограммы следует, что если учесть долю детей с уровнем ПАЛФ в плазме крови, превышающим верхнюю границу доверительного интервала (т.е. более 24,1 нг/мл), (в сумме составило в данной выборке 90,5%), то в качестве нижней границы адекватной обеспеченности витамином В-6 следует принять концентрацию ПАЛФ в плазме крови - 11 нг/мл.

На рис. 2 представлена метаболическая кривая (1) зависимости экскреции 4-ПК от содержания ПАЛФ в плазме крови для больных ФКУ детей, полученная путем объединения в группы близких по величине концентраций ПАЛФ и расчета для каждой образовавшейся группы среднего значения экскреции 4-ПК с мочой [16]. Между этими двумя показателями обеспеченности организма витамином В-6 обнаруживается высокая степень ранговой корреляции (табл. 1). Кривая расположена существенно ниже и сдвинута вправо относительно аналогичной кривой (2), полученной ранее для здоровых детей [14, 15]. Другими словами, у обследованных больных ФКУ детей содержание ПАЛФ в плазме крови выше, чем обычно наблюдается у здоровых детей, причем при одинаковой концентрации ПАЛФ в плазме крови выведение 4-ПК у больных детей существенно снижено по сравнению со здоровыми детьми того же возраста.

Для здоровых и больных сахарным диабетом людей кривая зависимости выведения 4-ПК от концентрации ПАЛФ в плазме крови имеет сигмообразную форму [8]. В данном случае кривая 1 (рис. 2) имеет двухфазный характер. Обращает на себя внимание отсутствие для обследованных детей пологой ветви, соответствующей низким концентрациям ПАЛФ, то-есть отражающей ситуацию, когда организм не насыщен витамином В-6, и при возрастании уровня ПАЛФ в плазме крови (диапазон концентраций ПАЛФ менее 10 нг/мл) экскреция практически не увеличивается. Возрастающая ветвь представленной кривой отражает функциональное состояние организма, при котором существует определенная пропорциональность между уровнем ПАЛФ в плазме крови и экскрецией 4-ПК с мочой (у=9,04х-19,13). Обычно это наблюдается в ситуации, когда организм насыщен витамином В-6. При концентрациях ПАЛФ свыше 20 нг/мл происходит переход в другое функциональное состояние, при котором экскреция слабо зависит от уровня ПАЛФ в плазме крови (у'=0,41х'+138,7), оставаясь практически на одном и том же уровне. Это может отражать наличие некоей лимитирующей стадии в метаболизме витамина В-6. Возможно, этим звеном является витамин В-2-зависимая альдегидоксидаза, окисляющая пиридоксалевые коферменты в 4-ПК [6].

Рисунок 2. Зависимость экскреции 4-ПК с мочой от концентрации ПАЛФ в плазме крови для больных ФКУ детей (1). По оси абсцисс - концентрация ПАЛФ в плазме крови, нг/мл; по оси ординат - экскреции 4-ПК, мкг/ч. В скобках рядом с точкой указано количество обследованных. Пунктирной линией нанесена соответствующая кривая (2) для здоровых детей [15].

В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что употребление больными ФКУ детьми дополнительно к рациону по 2 мг рибофлавина сопровождалось достоверным уменьшением концентрации ПАЛФ и тенденцией к снижению уровня ПАЛ в плазме крови, а также приводило к увеличению в 1,3 раза экскреции 4-ПК с мочой (табл. 2). Таким образом, средние значения обоих показателей приближались к параметрам, характерным для здоровых детей. Эти наблюдения можно рассматривать также как косвенный аргумент в пользу более высокой потребности больных ФКУ детей в витамине В-2. Кроме того, при дополнительном приеме витамина В-2 наблюдалась тенденция к уменьшению выведения с мочой ксантуреновой кислоты, экскреция которой возрастает у здоровых людей при нагрузке триптофаном в условиях недостаточной обеспеченности организма витамином В-6 [6].

Таблица 2. Влияние 3-недельного дополнительного употребления 2 мг рибофлавина в день на показатели обеспеченности организма больных ФКУ детей витамином В-6

Исследуемый показатель    n    Обследование    х+/-m    Пределы колебаний    Количество обследованных с уровнем ниже нормы, %

ПАЛФ, нг/мл плазмы    16    1

2    21,4+/-2,01

5,8+/-1,2*    10,1-38,1

9,6-26,1    56

44

ПАЛ, нг/мл плазмы    16    1

2    9,4+/-0,8

6,3+/-1,5    4,1-16,1

1,2-21,8    -

-

экскреция 4-ПК, мкг/ч    11    1

2    88+/-16

118+/-14    31-192

60-205    71

36

экскреция ксантуреновой кислоты, мкг/ч    9    1

2    92+/-15

60+/-13    35-241

31-131    -

-

Примечание: 1 - обследование до витаминизации; 2 - обследование после витаминизации. * - достоверное отличие (РЈ0,05) от показателя витаминизации.

Суточная экскреция 4-ПК с мочой у обследованных детей составила в среднем 10,9+/-0,7 мкмоль (2,08+/-0,13 мг) или 0,43 мкмоль/кг массы тела. По данным некоторых исследователей, выведение 4-ПК у больных ФКУ детей, получавших с рационом 39 г белка и 1,9 мг витамина В-6 или 46 г белка и 2,4 мг витамина, экскреция 4-ПК составляла, соответственно, 5,9+/-4 и 8+/-3 мкмоль/сут. [2]. В нашем случае используемая диета обеспечивала суточное потребление детьми 1,9 мг витамина В-6 и 51,9+/-0,5 г белка (0,037 мг витамина В-6 на 1 г белка), при этом экскреция 4-ПК составила приблизительно 80% от потребленного витамина В-6, что отличается от описанного в литературе (около 40% при потреблении 0,043 мг/г белка [2]). Суточное выведение этого метаболита у больных ФКУ несколько повышено по сравнению с измеряемым у здоровых обеспеченных витамином В-6 детей, у которых эти параметры, по данным разных авторов, обычно составляют 0,8 мг/сут. [2], или 0,12 мкмоль/кг массы тела в сут. [17]. При недостаточном потреблении витамина В-6 (1,3-1,4 мг) экскреция 4-ПК как у больных, так и у здоровых детей снижается и практически не различается между собой [2].

В целом, подводя итоги, следует отметить, что для большинства страдающих ФКУ детей характерно повышенное по сравнению со здоровыми детьми содержание ПАЛФ в плазме крови. Это наблюдение полностью согласуется с данными других авторов, обследовавших страдающих ФКУ детей 6-17 лет [2, 3]. По нашим данным, повышенный уровень ПАЛФ обнаруживается и у детей младенческого возраста. Так, у 6 обследованных детей в возрасте 2-9 мес. средняя концентрация ПАЛФ в плазме крови составила 15,9+/-3,7 нг/мл, при этом лишь у 2 детей она находилась в пределах, характерных для здоровых детей, а у остальных - была близка к 20 нг/мл.

Выявленная тенденция к нормализации показателей обеспеченности витамином В-6 у больных ФКУ детей при потреблении повышенных доз витамина В-2 указывает на необходимость дальнейших исследований по установлению оптимальных уровней потребления этих витаминов при данном заболевании.

Таким образом результаты проведенного исследования показали:

1. Для больных ФКУ детей характерно повышенное содержание ПАЛФ в плазме крови по сравнению со здоровыми.

2. В качестве нижней границы достаточной обеспеченности витамином В-6 мы склонны рекомендовать концентрацию ПАЛФ в плазме крови - 11 нг/мл.

3. При потреблении повышенных доз витамина В-2 показатели обеспеченности витамином В-6 больных ФКУ детей приближаются к наблюдаемым у здоровых.